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生物物理所解析Ⅵ型CRISPR,Cas系统研究中获进展

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12月15日,《分子细胞》(Molecular
Cell
)杂志在线发表了中国科学院生物物理研究所王艳丽课题组关于CRISPR-Cas系统的最新研究成果,文章标题为C2c1-sgRNA
Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism

1月12日,《细胞》(Cell)杂志发表了中国科学院生物物理研究所王艳丽课题组关于Ⅵ型CRISPR-Cas系统的效应蛋白C2c2的结构研究。标题为Two
Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase
Activities
。该研究解析了Leptotrichia shahii细菌中C2c2与crRNA
(CRISPR-RNA)
的二元复合物以及C2c2在自由状态下的晶体结构,揭示了LshC2c2通过两个独立的活性结构域来发挥其两种不同的RNA酶切活性,这为研究C2c2发挥RNA酶活性的分子机制提供了重要的结构生物学基础。

CRISPR-Cas系统由成簇且有规律间隔的短回文重复序列和它的相关蛋白构成,它是原核生物中的由RNA介导的获得性免疫系统,其主要功能是抵御外来入侵的遗传物质。另外,CRISPR-Cas系统还被广泛用于基因组编辑,其中CRISPR-Cas9的使用范围最广泛。最近新发现的另一种Cas蛋白C2c1,有着与Cas9类似的功能。这不禁让人想到:C2c1是否也可以被开发成新的基因编辑工具?王艳丽课题组的这一工作或许可以给这个想法的实现提供一些新的理论基础。

CRISPR/Cas系统是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统。CRISPR-Cas系统划分为两大类,第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能;第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1等)来发挥功能。其中,Cas9、Cpf1、C2c1均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性。目前,Cas9和Cpf1蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用,克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点,以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求,并有着潜在且巨大的临床应用价值。

科学,在该研究中,课题组成员解析了结合有sgRNA的C2c1晶体结构。该结构显示C2c1由两个区域构成,分别是具有识别sgRNA功能的REC区域和具有核酸酶功能的NUC区域。sgRNA是由crRNA和tracrRNA人工嵌合而成,其中,crRNA结合在C2c1的中心孔道内,tracrRNA则被安置在C2c1外表面的凹槽中。有趣的是,通过进一步观察,课题组研究人员发现C2c1对应的sgRNA呈现出一种与Cas9对应的sgRNA或最近报道过的Cpf1所对应的crRNA显著不同的结构。受到这个新结构的提示,研究人员一方面分析了其他物种的C2c1所对应的sgRNA结构,另一方面缩短了该sgRNA的长度,并进行活性实验,这两方面的结果都初步验证了这种独特结构的真实性和有效性。此外,该研究还发现目的序列的单个碱基突变可以显著降低C2c1剪切活性,这表明C2c1对靶定的目的序列有极其严格的要求,这一研究结果有助于开发新的基因组编辑工具,降低基因编辑过程中的脱靶现象。

2015年,一种全新的第二类CRISPR-Cas系统——Ⅵ型系统被发现,该系统中的效应蛋白被命名为C2c2。而后的研究进一步发现,Ⅵ型CRISPR-Cas系统是一种新型靶向RNA的CRISPR系统,而C2c2是一种以RNA为导向靶向和降解RNA的核酸内切酶,有望被开发作为RNA研究的工具,扩展CRISPR系统在基因编辑方面的运用。

王艳丽课题组的刘亮和陈鹏分别为本文的第一作者和第二作者,该研究得到科技部、国家自然科学基金以及中科院战略性先导科技专项的资助,上海同步辐射光源为该研究提供了重要的技术支持。

王艳丽课题组通过深入的研究,解析了C2c2与crRNA的二元复合物的晶体结构以及C2c2蛋白的晶体结构,揭示了C2c2包含一个crRNA识别的叶片即REC叶片,和一个核酸酶叶片即NUC叶片。REC叶片包含NTD结构域(N-terminal
domain)和Helical-1结构域,NUC叶片包含了两个HEPN结构域、Helical-2结构域以及连接两个HEPN结构域的连接结构域。负责切割前体crRNA和靶标RNA的活性口袋分别位于Helical-1和HEPN结构域上。crRNA的结合会引起C2c2蛋白的构象变化,这种变化很可能会稳定crRNA的结合,进而对识别靶标RNA起着重要作用。该研究通过结构和生化研究揭示了C2c2剪切pre-crRNA以及切割靶标RNA的分子机制,对认识细菌抵抗RNA病毒入侵的分子基础具有十分重要的意义。同时也为改造CRISPR-C2c2系统,为其在基因编辑领域的运用提供了强有力的结构基础,有助于加速对病毒感染引发的疾病的理解、治疗和预防。

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生物物理所研究员王艳丽为该文的通讯作者。王艳丽课题组博士后刘亮为该文的第一作者,该研究得到科技部、国家自然科学基金以及中科院战略性先导科技专项的资助,上海同步辐射光源以及日本同步辐射光源SPring-8为该研究提供了重要的技术支持。

图注:AacC2c1-sgRNA复合物的整体结构。 AacC2c1蛋白各结构域的分布;
结合有sgRNA的C2c1晶体结构的正交视图,B图为卡通结构,C图为表面结构,其中sgRNA的crRNA部分用红色显示,tracrRNA部分用黑色显示。

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图:LshC2c2-crRNA的二元复合物的晶体结构。

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